Silenciadores Geneticos tipo siRNA descricao de siRNA O termo siRNA se refere ao pequeno RNA de interferencia ou RNA de interferencia curto Exige transfeccao de celulas usando um reagente de transfeccao lipidico Util para "knock-down" transitorio Detalhes do Produto siRNA Silenciadores Geneticos siRNA sao "pools" de tres agentes especificos formados por moleculas de 19-25 nucleotides em fita dupla de RNA com a porcao 2-nt 3' livre em cada extremidade. 10 µ M, 50-100 transfeccoes Para verificar independentemente resultados de silenciamento de genes alvo, siRNA duplex individuais estarao disponiveis sob pedido. Produtos de apoio para silenciadores geneticos tipo siRNA: Anticorpos controle compativeis estao disponiveis RT-PCR Primers estao disponiveis siRNA solucao tampao diluida, sc-29527 siRNA Reagente de Transfeccao, sc-29528 siRNA Meio para Transfeccao, sc-36868 siRNA Sistema de Reagentes, sc-45064 siRNAs controle, incluindo Controle siRNA-A, sc-37007 Controle siRNA (Conjugato FITC)-A, sc-38869

Como funcionam os silenciadores geneticos do tipo siRNA?

http://www.scbt.com/pt/gene_silencers.html

Historia do RNAi

Primeiramente identificados em C.elegans pelos premiados com o premio Nobel, Fire e Mello, RNA de interferencia e uma das descobertas mais promissoras em biologia molecular. A atividade endogena de RNAi tem sido associada com a regulacao da motilidade de transposons, determinacao do perfil de expressao genetica, destino celular, sendo crucial componente na defesa celular inata contra infeccoes viroticas in vivo. Ha 3 mecanimos demonstrados e unicos de interferencia via RNAi para controle de expressao de genes alvos. RNAi regula a transcricao de genes alterando a formacao de heterocromatina. RNAi realiza duas formas de controle pos-transcripcional: 1) inibindo a translacao do mRNA alvo e 2) controlando a destruicao do mRNA alvo atraves do complexo RISC.

A descoberta do RNAi introduziu uma ferramenta laboratorial extraordinaria e poderosa para pesquisadores, a qual se transformou, posteriormente, em uma ferramenta terapeutica com potential promissor, e por isso, finalmente em 2006, os pesquisadores Andrew Z. Fire e Craig C. Mello ganharam o Premio Nobel em Fisiologia e Medicina.Em pesquisas laboratoriais, moleculas de RNAI estao sendo utilizadas para diminuir a expressao genes alvo unicos em diversos organismo e celulas, atraves dos 3 mecanismos de inibicao de expressao genetica descritos acima. Essas tecnicas sao uteis na manipulacao experimental para fins de estudo de genes especificos, funcao proteica e suas inter-relacoes com outros genes e proteinas. RNAi tem sido tambem reconhecido por seu grande potencial para usos clinicos.

Detalhes sobre esses mecanismos de interferencia via RNAi tem sido ampla e rigorosamente estudados, mas ainda ha muito a ser investigado. O controle do processo de RNAi sobre a degradacao do RNA mensageiro (mRNA) atraves do complexo RISC ainda e o mecanismo melhor descrito e tambem o mecanismo mais aceito para os mecanismos de silenciamento genetica via RNAi.

A Santa Cruz Biotechnlogy, Inc. oferece um linha completa de silenciadores geneticos tipo RNAi, incluido, siRNA, plasmideo shRNA e produtos de lentivirus para shRNA englobando mais de 99% dos genes codifadores de proteinas humanas e do camundongo.

A quebra do RNA mensageiro dirigida via RNAi

Extraído integralmente de: http://www.scbt.com/pt/gene_silencers.html

"Para além dos limites: aumentando a longevidade

Carta de Harvard

2006-04-06

Por Por Tiago Outeiro

Há uns anos atrás (sic), os cientistas acreditavam que o envelhecimento era, para alem da deterioração, o resultado do desenvolvimento programado codificado pelos nossos genes. Pensava-se que quando um indivíduo alcançava a maturidade os “genes do envelhecimento” iniciavam a sua actividade levando, em ultima instancia, a morte. Esta ideia caiu em descrédito, pensando-se hoje que o envelhecimento e apenas o resultado do “uso” e desgaste ao longo do tempo, uma vez que os mecanismos de manutenção e reparação do organismo perdem actividade e deixam de funcionar. Segundo a lógica da evolução e selecção natural, não faz muito sentido que o organismo mantenha esses mecanismos a funcionar depois de passar a idade reprodutora.

Vários investigadores, dedicados ao estudo de uma família de genes envolvidos em respostas de stress (como as altas temperaturas ou escassez de alimentos ou agua), descobriram que eles mantêm as suas actividades intactas independentemente da idade. Se conseguirmos manter estes genes activos durante o tempo suficiente, estes genes podem assim melhorar a saúde e prolongar a esperança de vida. Estes genes seriam assim os “genes da longevidade”.

Alguns genes descobertos recentemente afectam a resistência ao stress e a longevidade em animais de laboratório, sugerindo que possam ser parte de um mecanismo fundamental para sobreviver a condições adversas. Mas há outros tipos de genes envolvidos, como o gene chamado SIR2, que podemos encontrar em todos os organismos estudados ate hoje, desde os mais simples, como as leveduras, ate ao mais complexo, o homem. Copias extra deste gene aumentam a longevidade em vários organismos estudados em laboratório. E importante perceber se este gene tem efeitos semelhantes em organismos mais evoluídos, como em mamíferos.

O gene SIR2 foi dos primeiros genes da longevidade a ser descoberto, e por isso e o melhor caracterizado. Este gene foi descoberto em leveduras, quando os investigadores tentavam perceber os factores que causavam o envelhecimento dessas células. SIR2 foi descoberto como um gene capaz de atrasar esse processo. Como as leveduras não apresentam as tradicionais “rugas” que todos nos tentamos evitar, a forma de estudar o envelhecimento destas células consiste em contar quantas vezes as células mãe se dividem para produzir “filhas” antes de morrerem. A esperança media de vida de uma célula de levedura são 20 divisões.

Num processo chamado “screening”, para identificar células com maior longevidade, e assim caracterizar os genes responsáveis, uma mutação num gene levava a que a proteína Sir2 se acumulasse em regiões altamente repetitivas do genoma das leveduras. Nessa região do genoma existem mais de 100 cópias do chamado rDNA, que contem os genes que codificam para as “fábricas de proteínas” das células, os ribosomas. Esta região muito repetitiva torna-se muito instável, sendo muito difícil mantê-la sem que sofra alterações, porque e mais susceptível de recombinar consigo própria. Este tipo de eventos, recombinação de regiões repetitivas, pode levar a varias doenças no homem, incluindo a doença de Huntington, ou alguns tipos de cancro. Assim, tornou-se aparente que o envelhecimento em leveduras estaria associado com instabilidade no DNA, e que proteínas Sir poderiam atenuar essa instabilidade. Os investigadores descobriram depois que o que acontecia com esse rDNA era que, depois de algumas divisões, as células “cuspiam” algumas cópias extra desse rDNA sob uma forma circular. Estes círculos de rDNA são depois copiados, juntamente com o DNA genomico das células mãe, que não os passam as células filha, mantendo-os. As células chegam depois a um ponto em que gastam muita energia só para copiarem esses círculos de rDNA, comprometendo outros processos onde essa energia deveria ser gasta. Introduzindo uma copia extra do gene SIR2, a formação desses círculos de rDNA pode ser suprimida, e a longevidade das células aumentada em 30%.

Outras descobertas mostraram depois que copias extra desse mesmo gene, SIR2, tinham efeitos semelhantes noutros organismos de laboratório mais complexos. Estes genes estão envolvidos no silenciamento genético, ao promoverem uma maior compactação do DNA que torna os genes menos acessíveis, e inactivos. SIR significa, em inglês, silent information regulator."

Cópia integral de:  http://www.cienciahoje.pt/index.php?oid=2844&op=all

RNAi.wmv

A técnica de ARNi é relativamente nova, veja essa reportagem de 2006: 

“A interferência de RNA é uma técnica que permite “desligar” genes com precisão. O mecanismo, além de importante ferramenta de pesquisa, pode ter aplicação no combate a doenças que vão de infecções virais ao câncer.

Os norte-americanos Andrew Z. Fire, 47 anos, e Craig Mello, 45, laureados com o Nobel 2006 de medicina e fisiologia, dividirão o prêmio equivalente a US$ 1,36 milhão, cerca de R$ 3 milhões. Fire, professor de genética da Universidade de Stanford, e Mello, da Escola Médica da Universidade de Massachusetts, publicaram em 1998, na revista Nature, um artigo que descreve o mecanismo de controle do fluxo de informação genética. 

Na época, a dupla de cientistas estudava como a expressão genética é regulada no verme Caenorhabditis elegans. Descobriram que moléculas duplas de RNA (formado, em circunstâncias normais, por moléculas simples) são capazes de barrar a passagem da informação do DNA para o formato de proteína. 

O genoma opera enviando instruções para a fabricação de proteínas do DNA, no núcleo da célula, para o mecanismo de síntese protéica, no citoplasma, através do chamado RNA mensageiro. A interferência de RNA destrói o RNA mensageiro, impedindo a síntese de proteínas – o efeito, na prática, é semelhante ao “desligamento” do DNA. 

Ao disponibilizar uma ferramenta capaz de “desligar” qualquer gene, a interferência de RNA pode ajudar a desvendar a utilidade de dezenas de milhares de genes cujas funções são desconhecidas, segundo declaração publicada pelo Instituto Karolinska, da Suécia, responsável pela organização do Prêmio Nobel. 

“A interferência de RNA ocorre em plantas, animais e humanos. É de grande importância para a regulação da expressão genética, participa da defesa contra infecções virais e mantém sob controle os ‘genes saltadores’”, diz a declaração. “A interferência de RNA já está sendo utilizada como um método para estudar a função de genes e pode proporcionar novas terapias no futuro.” 

O anúncio do prêmio de Medicina e Fisiologia marca o início de duas semanas de premiações que terminam com o anúncio do Nobel da Paz no dia 13 de outubro. O Nobel de Física será anunciado nesta terça-feira (3/10) e o de Química no dia seguinte.”

Extraído literalmente de: http://noticias-biomol.blogspot.com/2006/10/interferencia-de-rna-ganha-nobel-2006.html .

Resumo sobre Silenciamento Gênico

Definição: processo de regulação gênica que visa “desligar” um gene.

Tipos:

• Knockout;
• Anti-Sense;
• Anti-Gene;
• ARNi etc.

Knockout

Definição: deleção de um gene específico (ou uma família de genes) de um genoma funcional.

Caracteríticas:

• Recombinação Homóloga;
• Formação de quimeras;
• Rendimento baixo;
• Custo alto;
• Dificuldade diferentes dependendo do modelo.

Anti-Sense

Definição:

• Oligonucleotídios (ON's) são sequências curtas (13 – 25 Mers);
• Sintéticas;
• Fita Simples de ADN ou ARN;
• Modificados ou Análogos.

Função: modular a expressão gênica por hibridização seletiva a sequência complementar do mARN ou pré-mARN alvo.

Características Terapêuticas:

• Habilidade de atingir a expressão de genes específicos;
• Pode ser usado para modificar a forma de splicing.

Mecanismo de ação:

• Inibição ou impedimento do transporte, splicing, 5´capping, 3´poliadenilação, tradução do ARN pela inibição da interação deste com outras moléculas como proteínas e outros ácidos nucleicos. *“Hybrid arrest” (impedimento híbrido).
• Quebra da estrutura secundária do ARN;
• Indução da RNAse L (ARN/ARN);
• Indução da RNAse H (ARN/ADN).
  
  
  Obs.: a Ação do Oligo-AntiSense é mediada por RNAse H que destrói seletivamente a fita de RNA do complexo heteroduplex RNA/DNA.
  *“Hybrid Arrest” – ligação do Oligo-AntiSense ao RNA inibe o ribossomo ou a polimerase de prosseguir na leitura do ARN.

Características funcionais:

• Afinidade diretamente relacionada com o tamanho do ON;
• Sequência de 17 Mers – esperada a ocorrência de uma vez no genoma;
• Aumento de afinidade em geral significa um aumento da potência;
• Formação de estruturas secundárias e terciárias do mRNA ou do oligo diminuem a afinidade;
• Dependendo do tipo de Oligo Anti-Sense degradam junto com a mensagem;
• Outros apresentam modificações químicas visando estabilidade (Resistentes a nucleases).

Aplicações: inibir a ligação do ribossomo (5´região), bloquear a tradução (região codificante) ou inibir o splicing (sítio splicing).

Anti-Gene

Sob certas circunstâncias o ADN pode adotar uma conformação de tripla hélice, que pode ser inter ou intramolecular.

• Tripla hélice intermolecular são formadas pela adição de uma terceira fita sequência específica ao sulco maior da dupla hélice de ADN.
• São sequências de tamanho entre 10 a 30 nt.
• São moléculas de polipurinas ou polipirimidinas que se unem a fita rica em purina do alvo.
• São ligantes específicos para dupla fita de DNA.

Aplicação: pode-se ligar a DNA e assim, inibir a iniciação e elongação da ARN polimerase assim como a ligação e ação de fatores de transcrição.

ARNi

Ver vídeos e reportagem.

Créditos: Octávio Luide.

Referências: 

ALBERTS et al. Biologia Molecular da Célula - 5ed – capitulo métodos – Manipulação de proteínas, DNA e RNA.

RNAi Keynote

Texto extraído de: http://www.olharvital.ufrj.br/2006/index.php?id_edicao=107&codigo=2

Silenciamento gênico: descobertas e possibilidades

Combater as invasões virais é um desafio há muito tempo. Cientistas e pesquisadores se desdobram nas descobertas de novas técnicas, experimentos e tecnologias na luta contra esses problemas. Esse é o caso do chamado silenciamento gênico por RNA, ou RNAi. Estudado a princípio em plantas e insetos, a técnica ganhou destaque há cerca de um ano, quando se descobriu o potencial de eficácia também em animais, como os humanos.

Para ajudar a compreensão desses processos, a professora Maité Vaslin de Freitas Silva, pesquisadora do Departamento de Virologia do Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes (IMPPG) da UFRJ, explica uma de suas linhas de pesquisa: o estudo de silenciamento gênico pós-transcricional em plantas resistentes ao vírus Andean potato mottle virus.

A pesquisa começou durante o doutorado da professora. Como tese, seu projeto era desenvolver plantas transgênicas resistentes a vírus. “Nessa época utilizei uma estratégia que consiste em tentar colocar pedaços do genoma do vírus em uma planta e, não se sabia explicar o porquê, mas a planta se tornava resistente a esse vírus” relembra Maité.  De qualquer forma, o que se observava era que várias linhagens transgênicas eram resistentes ao vírus, depois de sofrer esse processo.

Fato curioso era a ausência de ácido ribonucléico (RNA) transgênico. Normalmente, na produção de um organismo transgênico, insere-se o DNA desejado, que se comporta como um original, produzindo um RNA mensageiro transgênico que, por sua vez, completa o processo de síntese da proteína. “Para entender essa ausência, fomos investigar quando e onde esse RNA aparecia e era degradado. Os experimentos mostraram que, no núcleo, ele era produzido, mas quando chegava ao citoplasma ele era degradado”, explica a professora.

Esses experimentos, em conjunto com outros trabalhos da época, demonstraram o chamado silenciamento pós-transcricional (pois ocorre após o processo de transcrição). “Como essa seqüência era de um vírus, toda vez que uma seqüência igual entrava em células do vegetal que continha essa informação, ela era degradada, e por isso, o vegetal ficava mais resistente”, esclarece a pesquisadora. “Quando a planta era infectada com vírus, e este expunha seu genoma, como ele era homólogo ao fragmento do transgene, o vírus também era alvo desse mecanismo que estava ativado e era silenciado”, completa.

Sistema imunológico e silenciamento gênico: diferenças

Apesar de semelhantes em alguns pontos, os mecanismos de defesa do sistema imunológico e do silenciamento gênico são bastante diferentes, conforme explica a professora. Segundo ela, as vacinas, que utilizam o primeiro, funcionam a partir da produção de anticorpos. “Esses anticorpos então fazem com que a pessoa se livre do invasor, tendo sintomas da virose até que o organismo tenha uma quantidade de anticorpos suficiente para interromper a replicação viral”, explica.

Já no silenciamento gênico, o processo funciona como uma defesa anti-viral, mas não é um sistema de vacina, pois não tem relação com o sistema imunológico e na produção de anticorpo. “É um sistema que funciona diretamente destruindo RNAs mensageiros, que correspondem a invasores, normalmente”, complementa Maité. “Entrei nesse projeto por causa dos experimentos com a transgenia, mas depois foi visto que o processo ocorre naturalmente e os vírus, inclusive, têm proteínas que desligam isso — as supressoras de silenciamento”, relata a pesquisadora.

— Os mamíferos apresentam, sim, esse sistema. Contudo, ele é apenas mais um dos sistemas anti-virais e não se expressa com tanta relevância quanto o sistema imunológico. — esclarece a professora. Contudo, há algum tempo, descobriu-se que esse sistema era ativado também em células humanas, o que gerou esperanças na comunidade científica de uma nova arma anti-viral.

HIV e silenciamento gênico

Uma dessas especulações é em torno do vírus causador da AIDS – o HIV. Uma pesquisa de Kuan-Teh Jeang, M.D, Ph.D., do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID), parte do National Institutes of Health, colocou em pauta a possibilidade de se silenciar uma parte da estrutura do HIV. Para Maité, isso é viável, in vitro. “Em culturas de células humanas, foi visto que o RNAi funciona contra vírus HIV, para o vírus da dengue, rota vírus, entre outros”, conta. Ela lembra, também, que, desde 2002, vários vírus foram usados e viu-se que dentro dessas culturas de células o sistema de silenciamento funciona muito bem.

Algumas particularidades da possível técnica aumentam ainda mais o otimismo. Se o objetivo é, por exemplo, impedir que o vírus se replique nas células hospedeiras, basta introduzir uma seqüência pequena de RNA dupla fita (estrutura que desencadeia o processo) de alguma parte do genoma do vírus. Portanto, uma seqüência de 25 nucleotídeos poderia interromper a replicação de um vírus com um genoma de cerca de 200.000 pares de bases.

— Na época, esses dados geraram, de fato, um grande otimismo, em termos de poder usar o sistema como uma estratégia anti-viral. — conta a professora. Segundo ela, enquanto, em plantas, a resposta de silenciamento se espalha por todo o organismo, nos humanos o processo é diferente. “Em animais, existe a necessidade de se colocar sempre um indutor para aquela resposta. O silenciamento não tem esse espalhamento sistêmico. Ele funciona nas células, mas está sempre precisando receber o ativado”, explica.

Segundo a professora, essa diferença de comportamento entre vegetais e animais pode ter motivos evolutivos. “Já se sabe que as plantas possuem quatro enzimas básicas envolvidas nesse sistema. Especula-se que, por esse ser o principal mecanismo de defesa anti-viral dos vegetais, por motivos evolutivos, as plantas conseguiram desenvolver um sistema mais eficaz”, explica Maité.

Para a pesquisadora, o silenciamento é um potencial meio de combater os vírus, mas ainda há algumas respostas a serem encontradas. Com o foco em plantas, a pesquisa de Maité Vaslin, no momento tenta caracterizar mais proteínas supressoras do silenciamento. “O vírus consegue se replicar burlando o sistema de defesa, porque ele se associa com proteínas-chave desse sistema”, explica. “A pesquisa pretende, entre outros objetivos, entender como ocorre essa supressão do silenciamento” finaliza.